同种异体骨易感疾病控制

因同种异体骨材料移植导致感染或传染病感染是最严重的并发症和意外事件，按国际上相关标准筛选材料供体、在规定级别的洁净室按外科手术灭菌技术加工和选择合适的灭菌方法是预防此类事件发生的关键。对病史的认真调查和筛选，可使骨移植供体出现HIV抗体阳性率变得相当稀少, 机率估计少于百万分之一，如果移植骨经过了加工处理和伽马射线或环氧乙烷灭菌，其机率会降到更低。
但是，移植还是可能传播那些尚未知的和用现有技术不易检测的传染病，也可能因为供体处于感染的“窗口期”，而导致传染病的传播。此期间供体虽已感染，但是尚未产生抗体，这时供体血清学检验虽然是阴性，但是已经具有传染性。1981年美国首次报道艾滋病，1985年，美国组织和器官供体均需HIV-1血清学筛选，可是1985年10月21日1名22岁男性枪伤后32小时死亡，该供体处于艾滋病的“窗口”期，HIV血清学检测阴性。该供体提供的58件组织和器官中，有52件有记载，48个受体中的41个接受了HIV-1抗体检查。心、肝和双肾在切取24小时内移植，全部4个器官移植和3个未经加工的新鲜冷藏骨移植受体感染了艾滋病。34个其他组织受体的HIV-1抗体检测为阴性。其中，1例接受清除了骨髓的冷藏骨移植， 25例接受了清除骨髓、冷冻干燥和酒精处理的骨移植，3例接受了同样处理的筋膜和肌腱移植，3例接受了经辐照的硬脑膜移植,   2例接受了角膜移植。利用PCR技术检测保存的供体脾脏，HIV抗原为阳性。这说明在HIV抗体为阴性的窗视期，仍然有通过移植传播HIV的风险。经过清除骨髓、酒精浸泡、冷冻干燥、辐照灭菌等处理的骨和肌腱传播HIV感染的风险减小骨组织的灭菌要选择既能有效灭菌，又尽可能少的影响骨组织的生物学和生物力学功能，对受体无毒害作用的方法。美国组织库协会于1987-1988调查发现2/3的骨库用环氧乙烷、1/3的用伽马射线灭菌异体骨，1992年一项调查显示美国组织库协会认定的组织库成员中，有减少应用环氧乙烷灭菌的趋势，应用伽马射线灭菌是应用环氧乙烷灭菌的2倍

一、辐照灭菌
大多数成熟的灭菌方法有其某些方面的局限性，过去十几年，辐照灭菌是最广泛应用的灭菌方法。利用辐照灭菌骨组织，必须了解各种条件对骨组织物理学、生物学的影响，这包括：辐照射线的类型；有效的灭菌剂量；污染细菌和病毒的类型；骨组织形状、大小、结构，含水程度、温度、保存状态；包装；组织活化潜在的发展；生物力学的影响。

1.辐照的类型与特征
有至少6种类型的射线可用来灭菌组织（表6-3-1）：①X线能有效的灭菌，但灭菌时间漫长；② Gamma射线是最常用和渗透力非常好的辐照源，但完全灭菌常需12-24小时。虽然，增加辐照强度能缩短完全灭菌所需时间，但这样会导致组织升温发热；③ 加速电子在组织中与组织分子碰撞时产生Gamma射线和X射线来完成灭菌过程，使组织在短时间内获得有效的灭菌。然而，这些粒子带负电荷容易偏转、变慢，使之在组织中的渗透性下降，所以不能在深部组织中产生Gamma 射线和X射线达到灭菌效果；④ 中子能用于组织灭菌，但它引起组织高度的活化，所以没有临床应用价值；⑤ 质子和а粒子渗透性差，它们能灭菌单层包装的移植皮肤，但不能有效的灭菌骨组织。

表6-3-1   辐照射线的类型与限制特征

(ed. Friedlaender G.E., et al,   in Osteochondral Allografts, Little, Brown, Boston,1983. p224 )
2.辐照灭菌的机理
射线颗粒直接撞击细胞和细菌的核蛋白引起细胞致死。同时，射线颗粒使水分子裂成氢氧自由基致细菌死亡。组织的物理状态也影响细菌对射线的敏感性，冷冻干燥状态水分子少，且结构内水分子与分子结合紧，所以，要达到同样的灭菌效果，需要更大剂量的射线。常用的组织灭菌射线是Gamma射线和加速电子，Gamma射线是中性粒子，不产生偏转，能有效的渗透入骨组织。

3.灭菌的剂量
灭菌剂量受组织中细菌、病毒种类和灭菌前的初始菌量的影响，在同样初始染菌数量下，达到灭菌保证水平（SAL）的辐照剂量取决于微生物的D10值，D值反应了微生物对辐照的敏感程度，假如每增加1分钟照射的剂量可杀灭90％，存活10％的该类微生物，该剂量为这类微生物的D10剂量。不同微生物的D剂量差别很大，ISO/TC198根据不同D值微生物的标准分布给出不同初始染菌数量时不同SAL的辐照剂量，假如初始染菌不超过10，25kGy就可以达到灭菌保证剂量，原则上要用能彻底各种微生物的最小量射线计量，一次要灭菌尽量多的骨组织块，要在最短时间内完成所需剂量的灭菌。
每2Mvolts剂量的电子能渗透入水1cm，而此剂量仅提高组织温度5℃。因为冷冻干燥状态能最有效的利于射线渗透，所以电子灭菌最好用于冷冻干燥骨组织[30]。1.5Mrep的加速电子剂量杀死95%的细菌，而剂量3.0 Mrep时导致组织的破坏。所以，应用加速电子灭菌时组织灭菌剂量应为2.0-2.5 Mrep[18]。
De Vries应用1Mrep剂量的Gamma射线辐照时，格兰氏阳性球菌仍存活，2 Mrep剂量时所有细菌被杀死，当剂量大于2 Mrep时，方能杀死芽胞，但灭活脊髓灰质炎病毒需4 Mrep剂量的Gamma射线[9]。但是2 Mrep剂量的射线灭菌使骨组织碎性增加[31]。张旗研究证实2.5Mrads剂量的Gamma射线能导致骨基质易于吸收，新骨产量减少[33, 34]
R.W. Bright将狗的双侧尺骨切除一段造成缺损，一侧缺损植入冷冻干燥异体尺骨，另一侧植入同一供体，但经冷冻干燥和2.5 Mrads辐照处理的骨，经1年的追踪研究，结果显示：经辐照的6例植入尺骨，仅1例愈合，3例不愈合，2例吸收。而未经辐照的6例植入骨仅1例吸收，其余的均愈合。说明2.5 Mrads剂量的射线对骨的生物学愈合过程有损害作用。 探寻最小的辐照灭菌剂量，以减少这种损害显得尤为重要。将压碎的皮质或松质冷冻干燥骨放入含1.0百万枯草杆菌的试管中，分别用0.5-5.0 Mrads剂量的射线辐照。结果发现皮质骨和松质骨的完全灭菌剂量没有区别，冷冻干燥骨的灭菌剂量为1.5Mrads，而深低温骨的稍低，为1.0Mrads。 说明1.5Mrsds剂量的辐照足以杀灭污染严重的、对射线不敏感的、芽胞形成的致病菌，获得完全的灭菌[2]。
杀灭骨中HIV的剂量应根据骨组织中原始病毒的量来决定，辐照降低90％（a one-log reduction）的HIV需要0.4Mrads剂量的伽马射线（D10值）[7, 8]，急性感染期的早期HIV的含量最高[32]，预计1.2 Mrads剂量的伽马射线灭活最高含量的HIV病毒，使之仅存1个病毒体（a three-log reduction），另外加1.2 Mrads剂量使总量达到2.4 Mrads，使发现单一病毒活体的机率降低到百万分之一，达到灭菌保证水平（SAL）。
国际原子能机构对医用产品的伽马射线推荐灭菌剂量为2.5Mrads, 但是，冷藏异体骨中的HIV灭活剂量一直未确定。Fideler BM 对冷藏异体骨-髌腱-骨的研究证实2.5Mrads的伽马射线不能杀灭HIV,   3.0Mrads以上则能杀灭HIV。目前，各组织库常用1.5-2.5Mrads 剂量的伽马射线灭菌异体骨和韧带，因为过大剂量的辐照灭菌对骨的生物学性能会产生不良影响[11]。Campbell DG认为异体骨的HIV灭活剂量为3.5Mrads, 但要达到10-6灭菌保证剂量（SAL），则伽马射线的剂量要达到8.9Mrads，这大大超过了目前医疗产品的灭菌推荐剂量[5]。Smith RA研究发现1.5-2.5Mrads的伽马射线不能杀灭HIV-1病毒，甚至到5.0Mrads仍可呈现病毒复制。矛盾的结果可能与病毒的类型的差别、检测试剂和方法不同、感染病毒的含量不同有关。 因此，辐照灭菌可以灭活HIV病毒[5, 7, 8, 11, 12, 27, 29]，但是有效的灭活剂量可能会破坏骨的生物学活性，辐照灭菌不是防止因骨移植导致的HIV传播的安全方法，而应依赖于严格的血清学筛选和其他的加工方法[26]。
灭菌时间延长会致组织发热，影响骨组织中骨形态发生蛋白的稳定性, 组织在干燥条件下，则灭菌过程中温度不升高。辐照灭菌时，不仅对射线的类型、剂量、渗透性和移植骨块的几何形状和组织的含水状态与灭菌效果的关系要研究，组织的包装对灭菌效果的影响也要考虑。玻璃容器经辐照后颜色变黑，影响观察容器中的内容物。

二、化学灭菌
理想的骨组织灭菌溶液必须能杀灭表面和骨间隙中所有微生物，包括细菌、病毒、霉菌和细菌内胞子。同时，保留植入物基本的物理和化学特征，溶液的有害残留液和它们的毒性代谢产物能稀释、排出，以防止对病人产生毒副作用和诱发瘤变。
各种灭菌溶液通过对微生物的选择性毒性作用来杀灭细菌，能破坏微生物核酸和蛋白的溶液有乙醇、烷基化物、卤素化合物。对细菌细胞膜有破坏作用的化学物有抗菌素、酚类化合物，四价铵化合物。许多抗菌素对细胞壁合成有影响，一氮蒽和某些抗菌素对核酸合成有影响。理想的灭菌溶液应能选择性的作用于微生物，而对骨组织中的骨形态发生蛋白无损害。乙基和异丙基醇是有效、且安全的消毒溶液，但不能杀灭芽胞。酒精不影响骨基质的骨诱导蛋白活性，虽然酒精是通过使细菌的蛋白质变性的作用来杀灭细菌。但不能灭活那些没有脂溶性包裹的微小病毒和HAV病毒[1,14]。Anastasescou M研究认为人体肌腱浸泡在70％的酒精中2小时，肌腱中的浓度达到14％。3小时后达到19％。作者得出结认，肌腱中要达到有效地HIV灭活浓度，肌腱至少要浸泡在70％的酒精中3小时。也有报道盐酸能灭活HIV病毒[19]。
    有机汞化合物一直用作骨组织消毒，后研究发现该化合物消毒不彻底，且在较高浓度时影响骨诱导蛋白活性，使骨移植融合失败率达30%。
用于骨组织灭菌的烷基化物包括甲醛、β-丙烯内脂和环氧乙烷，这些化合物通过破坏许多蛋白分子的氢硫化物、氨基、羟基、羧基组来发挥其灭菌作用。最近的研究显示：核酸嘌呤和嘧啶基上亲核N组的烷化是灭菌的主要作用机理，氨基酸的烷化和酶系统的灭活也是重要的。环氧乙烷是最有效，而且对骨诱导蛋白的活性损害较小的化合物，环氧乙烷一直成功的应用于骨灭菌，它能渗入皮质骨，且易于从骨组织中排出，其残留浓度极低。但是因为环氧乙烷及其代谢产物（乙烯氯醇和乙烯乙二醇）可能致癌，有些骨库已经不将其作为骨灭菌的手段。甲醛使骨蛋白变性，引起骨诱导能力不可逆转的损害。β丙烯内脂因其致癌作用，已从市场上淘汰。
D.J. Prolo将狗的冷冻干燥颅骨分作环氧乙烷组、Gamma射线组、甲醇/三氯甲烷/碘酸组和控制组进行灭菌, 结果显示:甲醇/三氯甲烷/碘酸组的成骨能力最好。他们还对环氧乙烷对枯草杆菌（一种抵抗力很强的内生胞子）的灭菌进行了研究，检测了环氧乙烷渗入皮质骨（cortical bone）的深度和其代谢产物环氧化物，氯化氢乙烷（ethylene chlorohydrin）和乙二醇乙烷 (ethylene glycol) 在组织中的浓度，发现在灭菌前清除骨髓及所有来源的氯离子和水份，对降低和防止产生残留的环氧乙烷及其代谢产物是很重要的。灭菌后充气和丙酮提取这些残留物前，骨组织复水有利于这些残留物的进一步排出[22]。张旗研究发现环氧乙烷在40℃时灭菌，对骨基质诱导新骨形成的能力没有明显影响。但是，在55℃时则使骨基质的成骨能力完全丧失[33, 34] Prolo用环氧乙烷灭菌了2959个同种异体骨及其它组织，无一例在临床应用后发生感染[21]。环氧乙烷也可以灭活HIV病毒[10]
抗菌素不损害骨诱导蛋白，但其渗透能力和灭菌效果，致今未作系统研究，所以它在骨灭菌方面的应用受到限制。

三、热灭菌法
Hofmann 用80℃热灭菌方法处理异体骨，总结了来自于380个供体的400块异体骨，经热灭菌后730个送检样品中的5个细菌培养为阳性。因为，正常情况下细菌在80℃灭活，因此这5例为二次污染所至。认为热消毒系统的应用，可以大大提高产品的安全性[13]。HIV可被热灭活[10]，动物及临床研究证实用65℃热处理异体骨不影响骨的愈合，传统处理的异体骨并发症的发生率为10.7％；热处理的为11.4％[15]。56℃30分钟能灭活血液中的HIV, 60℃证实灭活骨中的HIV, 并且对骨的力学特征和成骨能力没有影响
     Marthy将艾滋病患者的骨组织冷藏在-80℃1-12周后，用p24抗原检测仍为阳性，说明冷藏过程不能杀灭HIV[17]。冷藏后，有些原来含HIV的骨样本，不能再培养出HIV病毒。但另外一些冷藏后，即使又清除了骨髓和经过了冷冻干燥处理，仍然可以培养出HIV病毒[3]